首先從細(xì)胞培養(yǎng)開始吧。我用的是A549，A549總體感覺還是好養(yǎng)的，也不嬌氣。A549的培養(yǎng)絕大多數(shù)的文獻(xiàn)都說用1640，但是我的體會是用DMEM更好，因?yàn)榻?jīng)高人指點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)A549在偏減性環(huán)境長得更好。一開始也是用1640，細(xì)胞總是有部分漂起來，即便是用PBS洗后仍然會有部分漂浮。后來換成DMEM,且血清最好用GIBCO的。以后細(xì)胞就開始長好了。這種細(xì)胞對濃度依賴更強(qiáng)，所以在傳得時(shí)候濃度要高一點(diǎn)，最好一傳二。最好是細(xì)胞鋪滿瓶底80-90%時(shí)，就傳。傳晚了細(xì)胞就疊層。有幾次傳稀了，細(xì)胞就集中在一些地方長，沒有均勻的鋪展開來。甚至細(xì)胞就在扎堆的地方疊層生長，也不連接成片，這樣的細(xì)胞自然不能拿去接種。這樣就只能消化下來原瓶傳，以后細(xì)胞漸入佳境。
到快要接種前兩周，我基本上是一天傳一次。用于接種的細(xì)胞最好傳15代后再用，因?yàn)榇鷶?shù)越高，活力越強(qiáng)，細(xì)胞生長非常好。由于我的實(shí)驗(yàn)接種的濃度較高，所以我用75cm2的瓶，整整養(yǎng)了99瓶。現(xiàn)在回想起來，真不知當(dāng)時(shí)是怎么熬過來的。主要是A549個(gè)頭較大，所以75cm2的瓶長的滿滿的也就在106，如果按文獻(xiàn)5×107（大多數(shù)文獻(xiàn)），我接種60只，還得繼續(xù)擴(kuò)大瓶數(shù)，不過我發(fā)現(xiàn)106數(shù)量級就非常好了，不一定必須是5×107。這或許跟我最后細(xì)胞的狀態(tài)有關(guān)。另外我發(fā)現(xiàn)A549更喜歡玻璃瓶，而且是玻璃瓶越小越好，不知是我的主觀感覺還是事實(shí)就是這樣。因?yàn)橐婚_始我是用玻璃瓶養(yǎng)，后來計(jì)算，發(fā)現(xiàn)用量需很大的量時(shí)，才改用75cm2的塑料瓶。
關(guān)于細(xì)胞養(yǎng)的過程中的一些細(xì)節(jié)：1）雙抗的配制：去一支80萬單位的青霉素溶于4ml的NS，再取一支100萬單位的鏈霉素溶于5ml的NS，取4ml與前者混合節(jié)。1ml分裝與1.5美麗的EP管，-20℃保存，臨用前再解凍。2）消化細(xì)胞胰酶最好用GIBCO的。可以將胰酶分裝在1.5ml的EP管里，每管1ml，-20℃保存，臨用前再解凍。3）完培、PBS、胰酶均沒必要提前溫浴，4℃拿出即可用。4）消化細(xì)胞時(shí)由于選用GIBCO的，所以沒必要在培養(yǎng)箱里消化，室溫即可。時(shí)間1分鐘左右。1ml的胰酶可以重復(fù)利用，可消化4瓶細(xì)胞，甚至可以消化6瓶，不過越到后面消化所需的時(shí)間就越長。這樣對細(xì)胞不利，因?yàn)槠坷餂]有完培了。當(dāng)然消化之前必須用PBS洗。如果不洗的話，在吹打時(shí)就比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力了。所以洗很關(guān)鍵，因?yàn)镻BS液可帶走殘留的血清，以提高酶的活性。5）消化細(xì)胞時(shí)一定要掌握好火候，鏡下觀察到細(xì)胞連接松散了，即立即停止消化。吸走胰酶用于下一瓶的消化。6）加入完培吹打，此時(shí)可沿瓶底快速擠入完培，如果手勁夠大的話幾乎不用吹細(xì)胞都已經(jīng)掉下來了。吹打時(shí)間竟可能短一些，氣泡少一些。對于A549來說，可以快速地吹一二十次即可，因?yàn)镚IBCO的胰酶消化效果非常好。不過反復(fù)使用后，應(yīng)該適當(dāng)延長消化時(shí)間，且盡可能的把PBS吸干凈。7）加好完培后輕輕晃一下培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。特別提醒，首次復(fù)蘇的細(xì)胞，不要總?cè)铀梢缘?天再去換液。因?yàn)閯倧?fù)蘇的細(xì)胞較嬌嫩，不易頻繁去動它（新手容易犯這樣的錯(cuò)誤）。
和多數(shù)文獻(xiàn)一樣接種后A549是有些長的慢，我的實(shí)驗(yàn)在第18天時(shí)，60只里有48只到達(dá)遴選標(biāo)準(zhǔn)（100-300mm3），剩下20只，有2/3較小、1/3超過均不能用。我自認(rèn)為接種成功率比較高了，當(dāng)然這得益于我身邊有一位近40年經(jīng)驗(yàn)的高人。許多人接種率不高的原因，我個(gè)人體會是，除了與你的瘤株的活性（無論你是體外培養(yǎng)，還是體內(nèi)培養(yǎng)）有密切關(guān)系外，還有就是動物的周齡，我個(gè)人體會最好4周，動物買來后適應(yīng)1天就接種。還有后期管理也很重要，特別是NS組，有些人就不給NS，認(rèn)為沒必要，其實(shí)很重要，NS組瘤重平均值應(yīng)該在2g-3g，標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)在平均值的1/3-1/4，否則數(shù)據(jù)根本就不可信，實(shí)驗(yàn)就是白做。決定成功率的還有一個(gè)關(guān)緊因素是，接種部位，這個(gè)非一日之功。我的成功率較高（姑且自詡一下），正如我前面所說，身邊有高人太重要了。所以在這里斗膽建議大家在做類似實(shí)驗(yàn)時(shí)，身邊一定要有高人指點(diǎn)，否則你可能會走很多彎路，這樣寧可不做。無論你是用什么鼠，在接種時(shí)，首先就是如何抓動物。在抓動物時(shí)每一只的手法和力量要盡量一致，抓好后把動物側(cè)面面向自己，此時(shí)小鼠的身體呈一弧形，整個(gè)側(cè)面的皮膚繃緊。用小手指先壓住尾巴，再把右后肢向尾部反向拉一下（注：左手抓動物），再用無名指壓住右后肢。此時(shí)整個(gè)小鼠的、用來注射的側(cè)面的皮膚已經(jīng)繃得較緊了。這樣做的目的是保證細(xì)胞懸液在注射后都集中在比較小的區(qū)域，不至于四處擴(kuò)散，反而使局部的濃度減少，影響到成瘤和瘤塊的均一性（不過均一的瘤塊是可遇不可求的一件事！）。大家可能覺得裸鼠掌握不好注射部位，因?yàn)槁闶蟮钠つw彈性差。其實(shí)裸鼠更好注射，因?yàn)槁闶篌w表無毛，皮膚是看的見的，有沒有在皮下很容易感覺得到。反而是其他有毛的小鼠看不見皮膚，需要小心一點(diǎn)。
進(jìn)針點(diǎn)的選擇你可以選離腋窩大概1.5cm的地方。如果我們從腋窩沿身體的側(cè)面（正俯位的右側(cè)）貼著軀體表面與軀體平行劃一根線的話。那么進(jìn)針點(diǎn)就應(yīng)該選在離腋窩1.5cm、“線”的左側(cè)。針頭進(jìn)去后應(yīng)該斜向下（偏右方向）到達(dá)腋窩空曠的地方，剛好是6號針頭的2/3(注意：針頭不能太小，否則易堵。有一次我用4號就有點(diǎn)堵，當(dāng)時(shí)是瘤塊的勻漿。)。之前肯定要消毒干凈，而且面積大一些好點(diǎn)。因?yàn)楫吘孤闶竺庖吡Φ汀＜?xì)胞懸液最好注射在腋窩離得腋下靜脈叢周圍，且不要傷及靜脈。聽起來好像很懸吧，其實(shí)做多了，感覺就來了。這樣就會保證你每只都接種成功。皮下接種最好選擇腋下，因?yàn)檫@里血流豐富，可保證瘤塊很好的生長。
在無菌室制備好的細(xì)胞懸液，最好用一無菌的玻璃瓶（一定要帶膠塞）裝好，再置于冰面上，再帶到動物房注射。許多教科書多說，從消化細(xì)胞開始到制備成懸液，再到接種最好在30min內(nèi)結(jié)束，我覺得這有點(diǎn)不切實(shí)際。如果是接種一兩動物是可以做到的，但幾十只時(shí)，無論是什么樣的高手也做不到。以我為例，我接種60只，我養(yǎng)了99瓶細(xì)胞，我從上午8點(diǎn)開始處理細(xì)胞，一直到下午3點(diǎn)才把細(xì)胞懸液制備好（3個(gè)人分工協(xié)作），反而是接種只花了30min。
在接種細(xì)胞時(shí)，每一只動物的用量一定要統(tǒng)一，且注射器在吸得時(shí)候也一定要非常準(zhǔn)確，這對于將來的成瘤影響很大。每次吸時(shí)一定要充分混勻，且搖的次數(shù)都要一樣，千萬不要小看這些細(xì)節(jié)。由于裸鼠的皮膚彈性有些差，所以當(dāng)完成注射，將針頭拔出時(shí)會有明顯的針眼，因此在注射完懸液和拔針之前最好下壓針頭，以免液體從針眼處流出，導(dǎo)致注射的量減少，使瘤塊不均一。當(dāng)然注射前的消毒工作一定要做好，這毋庸置疑。特別是脫碘時(shí)一定要干凈，否則會將碘帶入裸鼠體內(nèi)，那你就只有哭了。裸鼠太嬌貴了。
接種使用組織瘤塊好，還是細(xì)胞好。要根據(jù)你的模型需要決定。我用的A549移植瘤模型就應(yīng)該選“細(xì)胞”，因?yàn)锳549成瘤慢。如果用“組織瘤塊”的話，可能要花3個(gè)周期（每個(gè)周期20天左右，體內(nèi)必須傳3代后才能用。如果有現(xiàn)成的成瘤裸鼠賣的話就另當(dāng)別論了，買來就可以用。）
